FlowJo下载

FlowJo是一款功能强大的流式细胞剖析软件，兼容几乎所有流式细胞仪收集的数据。其操作简便功能全面，能够帮助用户轻松掌握细胞状态的变化。软件具备流动性室和流液驱动器系统、光电转换器和数据处理系统等先进的科技组件。

软件功能详解

单色样本分析

在单色样本分析中，常见的动态显示为单参数条形图。横坐标轴通常表示线性平均误差或多数平均误差，代表检测的荧光或透射光的强度；纵坐标则表示横坐标轴某一特定荧光强度的细胞数，有时也用相对性百分比来表示。以3 color comp文件夹中的CyPE comp.fcs文件为例，进行以下分析：将此文件拖至桌面，再将其拖入FlowJo的组室空间中。在组室空间中选中“3 color comp”组，样本空间中将显示该组内的所有样本。双击“Cy5PE comp.fcs”，出现图形对话框。此为二维点图，X轴选择SSC（侧面散射光，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，SSC越大，相反越小），Y轴选择FSC（前向散射光，细胞越大，FSC越大；相反越小）。选择合适的设门工具（矩形框门、椭圆形门、不规则图形门、感应门），在二维点图中选定淋巴结细胞。双击选定的淋巴结细胞，出现新的图形对话框。在X轴选择Cy5PE:CD4，Y轴选择Histogram，选择设门工具（地区门、双分门）中的一个，在单参数条形图中设门。

多色样本分析

多色样本分析包括双色、三色及以上的样本。横坐标轴和纵坐标轴分别代表与细胞相关的2个独立参数，平面图上的每一个点代表具有相对平面坐标的细胞。以三色样本为例，选择3-color-experiment文件夹中的931115-B02-Sample01.FCS进行分析。双击样本出现二维点图。X轴选择FSC，Y轴选择SSC。选择不规则图形设门工具，在二维点图中选定淋巴结细胞。双击淋巴结细胞门，出现图形对话框，X轴选择Fluor::CD3，Y轴选择FSC。使用矩形框设门工具选定CD3阳性细胞，设门并命名为T细胞。双击T细胞门，出现图形对话框，X轴选择Cy5PE::CD4，Y轴选择PhyEry::CD8。使用十字门设门工具设门（拖拽鼠标将四分门挪至总体目标部位，一般依据细胞分群趋势，四分门的定义线可建在呈阴性、呈阳性细胞的分群处），如下图所示：

Q1：CD8单阳性细胞，为CD8 T细胞 Q2：双阳性细胞 Q3：CD4单阳性细胞，为CD4 T细胞 Q4：双阴性细胞

细胞凋亡（Cell Apoptosis）

将细胞凋亡样本拖入，双击原始记录开启图形对话框。X轴选择FSC-A，Y轴选择SSC-A。分析细胞凋亡的细胞选择图中所显示的细胞群进行分析。细胞碎片未进行分析。在SSC/FSC图上双击“分析的细胞群”，X轴选择FITC，用于表示AnnexinV-FITC。Y轴选择PE-Texas，用于表示PI。使用四分门设门工具定义活细胞和细胞凋亡细胞。如下图所示：

Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI，此区域的细胞为凋亡细胞。也很有可能有极少数的末期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包括在其中。 Q2: (AnnexinV FITC) /PI，此区域的细胞为末期凋亡细胞。 Q3：(AnnexinV-FITC) /PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。 Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。一般统计分析细胞凋亡率时选用Q2 Q3，末期凋亡+早期凋亡群（即全部AnnexinV呈阳性群）。

细胞周期时间（Cell Cycle）

细胞周期时间的检测是流式细胞仪更为普遍的应用之一。细胞周期时间是指以有丝分裂方法繁殖的细胞从等位基因解体完毕到子细胞解体完毕所经历的全过程。一般由G1期、S期、G2期和M期构成。细胞在G1期进行必要的发展和化学物质准备，在S期进行性染色体DNA的复制，在G2期进行必要的前期修复，以确保DNA复制的准确性。在M期进行遗传到子细胞中的平等分配，使细胞进行裂解。细胞周期时间检测中PI更为常见。PI为插入性核苷酸荧光染料，能选择性地置入核苷酸DNA和RNA发夹结构的碱基中间与之融合，其融合的量与DNA的成分成正比例关系，用流式细胞仪进行检测，就可以获得细胞周期时间每个阶段的DNA分布情况，进而计算出每个期的百分比。

以cell cycle文件夹中的5206.001，PI染色为例，设门选择目标细胞群，将细胞碎片清除在外。即双击操作台中的5206.001样本，开启图形对话框。X轴选择FSC-H，Y轴选择SSC-H，细胞碎片位于左下方的位置，设门选择目标细胞，如下图：

设门选择要开展细胞周期时间分析的单细胞群，清除粘连细胞（粘连在一起的双细胞或多细胞低回声区等）的干扰。X轴选择FL2-W(width)，Y轴选择FL2-A(area)，设门方法如下图：

BD的流式仪收集的数据：在开展周期时间分析的情况下，一般是选用FL2-A与FL2-W（或FL2-A与FL2H）进行设门。

Beckman的流式仪收集的数据：X轴选择FL3-LIN，用于表示PI的线性数据信号。Y轴选择FL3-PEAK，用于表示PI的最高值数据信号。设门方法如下图：

在FlowJo操作台中选定“单细胞群”这一连接点，在工具栏的“工具”中选择“细胞周期时间”，开启周期时间分析对话框。获得G1期、S期、G2期细胞百分比，G1期CV值和G2期CV值等数据信息。图上粉红色的曲线图为周期时间线性拟合的实体模型曲线图，灰黑色的为样本曲线图。理想情况下粉红色和灰黑色曲线图符合一致为最好。线性拟合的优劣可以依据右侧的RMS值来分辨。RMS(root mean square error)值越低越好，当周期时间线性拟合不太好的情况下，可以根据更换拟合模型（Watson和Dean-Jett-Fox）或变更限制标准（G1是G2的二倍）进行调节。而G1/S/G2百分比：G1/S/G2期细胞所占的百分比。G1/G2均数：G1/G2期细胞荧光强度的平均值。CV（Coefficient of Variation，变异系数）：仪器因素和试品制备及上色过程对标本采集的人为因素干扰。一般G0/G1峰的CV来检验屏幕分辨率或精度。G1 cv/G2 cv：G1/G2峰的变异系数，其大小体现了G1/G2峰的总宽，值越小，峰越窄。

应用特点

FlowJo操作简单易学，且TOP10免疫学刊物上的文章内容大部分全是用FlowJo分析数据。使用好FlowJo对发表高分文章有非常大的帮助。

如何使用

单色样本分析：

将样本拖入FlowJo，选择合适的参数进行设门。

分析二维点图，了解细胞特性。

多色样本分析：

将样本拖入FlowJo，选择合适的参数进行设门。

分析二维点图，了解细胞特性。

根据需要进行细胞分群。

细胞凋亡分析：

将样本拖入FlowJo，选择合适的参数进行设门。

分析二维点图，了解细胞凋亡情况。

细胞周期时间分析：

将样本拖入FlowJo，选择合适的参数进行设门。

分析二维点图，了解细胞周期时间分布。